益生菌群維持腸道健康的分子機制閱讀次數(shù) [7792] 發(fā)布時間 :2016-04-10
益生菌群維持腸道健康的分子機制
黃東彥，朱劍鋒，胡學華，胡學生，周海泳，龐旭，胡文鋒
摘要
益生菌的益生效果在過去已經(jīng)得到大量的動物試驗證明，但對于其益生作用的分子機制的研究尚不能完全滿足指導實踐應用，益生菌制劑的益生效果不穩(wěn)定、不顯著的問題仍存在。近年來大量針對益生菌及腸道細胞、益生菌對致病菌和益生菌對疾病的相互作用機制進行了研究，并取得了一些成果。本文綜述了以上三方面作用機制研究的進展。
1前言
人類對于腸道益生菌群的研究歷史非常久遠，盡管如此，針對腸道健康的發(fā)酵產(chǎn)品直到20世紀初才開始深入研究。在諾貝爾獎得主Metchnikoff提出益生菌概念后，益生菌倍受人們關(guān)注，研究的方面包括提高消化能力、供給營養(yǎng)、抵御致病菌和菌體自身作為抗體的功能等等。但過去的研究大多處于宏觀試驗階段，益生菌的益生機理尚未完全研究清楚，尤其是基因激活調(diào)控方面還有廣闊的研究空間。而在21世紀初，隨著分子生物技術(shù)手段的發(fā)展，腸道益生菌群的作用機理得到更多的研究，從體內(nèi)試驗轉(zhuǎn)為體外試驗，從而對益生菌群與腸道細胞的互相作用機制、益生菌對致病菌的屏障作用等等獲得深入的研究成果，本文將對這些新成果進行簡述并分析未來的研究方向。
2益生菌群與腸道細胞相互作用機制的研究
對于腸道細胞，由于其組成的復雜性使體外研究長時間處于探索體外培養(yǎng)技術(shù)的階段，而近年來由于腸道細胞培養(yǎng)技術(shù)的成熟，研究者們開始針對研究腸道益生菌群和各種不同的細胞間的關(guān)系。
2.1益生菌群對腸道上皮細胞的激活作用
腸道上皮表面積約400平方米，且長時間與大量腸道微生物接觸，與腸道益生菌群時刻保持接觸交流，因此腸道上皮細胞是保持腸道微生態(tài)平衡的關(guān)鍵之一（McCole and Barrett, 2007）。對于很多腸道疾病，越來越多的證據(jù)證明腸道菌群對調(diào)節(jié)腸道免疫應答有著重要的作用，例如可能存在某些識別特定微生物成分的基因表達程序可抵御微生物威脅（Sansonetti, 2004），如尾相關(guān)同源異型域蛋白（Caudal-relate homeodomain protein, Cdx2）和肝臟核因子1α（hepatic nuclear factor 1α, HNF1α）等（Mitchelmore et al., 2000）。
有研究稱存在一類哺乳動物模式識別受體(mammalian pattern recongition receptors, PRRs)可以識別細菌和病毒的外形結(jié)構(gòu)從而激活前炎癥代謝途徑，其中三種PRRs尤為受關(guān)注。一種為類鐘形受體（Toll-like receptors, TLRs）；另一種為核苷酸結(jié)合寡聚域分子（nucleotide-binding oligomerizetion domain molecules, Nod）；還有一種為C型外源凝集素（C-type lectins, CLRs）。TLR、Nod和CLRs均具有識別菌體表面蛋白的能力，相比之下，TLR的調(diào)節(jié)作用更為明顯。TLR通常與細胞膜密切相關(guān)，一般擁有外露的富亮氨酸重復識別域和胞內(nèi)白細胞間介素受體（interleukin-0000
1 receptor, IL-1R）識別域，例如TLR4可識別革蘭氏陰性菌（G-）細胞壁的脂多糖（LPS），TLR5則可以識別細菌的鞭毛蛋白（flagellin）。而這種識別能力可調(diào)節(jié)某些代謝途徑，如上皮細胞識別TLR2或TLR9的結(jié)合體可以增加腸道屏障層的保護作用（Cario et al. 2004）。
通過對TLR系列蛋白的研究，表明TLR與Nod能激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（Nuclear factor κB），從而激活受NF-κB控制的前炎癥基因的表達（Dupraz et al., 2000）。Kelly等發(fā)現(xiàn)當腸炎沙門菌Salmonella enteritidis被TLR識別后，可通過IkB激酶（IkB kinase, IKK）激活NF-κB，從而使RelA基因表達；同時還發(fā)現(xiàn)益生菌群中的多形擬桿菌Bacteroides thetaiotaomicron可減緩炎癥基因的過度表達，如圖1。
圖1 TLR與激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的作用機制（Kelly et al., 2005）
關(guān)于TLR和Nod的作用有大量的小鼠動物試驗也得到類似的結(jié)果，而結(jié)果證明TLR對腸道免疫細胞的作用更大，能激活T細胞及Th（T helper）細胞免疫相關(guān)的IL-1β和IL-6等。而體外試驗方面，菌株與腸道細胞系共培養(yǎng)結(jié)合Real time PCR的技術(shù)使用較多。Romanin等（Romanin et al., 2010）利用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000熒光檢測系統(tǒng)轉(zhuǎn)染人源腸道上皮癌細胞系Caco-2，其中的熒光素酶的表達受3X-κB啟動子（NF-κB控制的基因之一）控制，和TLR5組合使用可以用于檢測可以激活腸道細胞的微生物。通過這種方法篩選出來的24株酵母和23株細菌，再利用Sougioultzis在2006年使用過的細胞接觸培養(yǎng)法共培養(yǎng)菌株與重組的Caco-2細胞系，利用小鼠腸道環(huán)結(jié)扎模型和Real time PCR檢測相關(guān)益生基因的表達量變化（Sougioultzis, 2006）。結(jié)果表明酵母K. Marxianus CIDCA 8154能高效提高熒光蛋白CCL20的表達量，同時很多前炎癥因子如IL-1β和TNF-α等的表達量也有大幅度提高，從而表現(xiàn)出菌株對腸道細胞的免疫調(diào)節(jié)機制。
另外，對于可以減弱腸道發(fā)炎癥狀的誘導型—氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）和發(fā)炎調(diào)節(jié)劑過氧化物酶體增殖激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor-gamma, PPAR-γ）等也是益生菌免疫調(diào)節(jié)機制的研究熱點，但其作用主要為輔助作用（Zanello et al., 2009）。
而腸道上皮細胞的研究方法已經(jīng)發(fā)展出一些較為成熟的系統(tǒng)：常用的動物腸道細胞系有Caco-2、HT-29、HCT116以及HeLa等；培養(yǎng)基多數(shù)選用DMEM或RPMI配合5%-10%小牛血清；檢測基因表達的微矩陣基因芯片有人類細胞因子表達矩陣等，而除了常規(guī)的粘附培養(yǎng)搭配細胞表面定植培養(yǎng)法，還有半透膜雙層隔離共培養(yǎng)法等新技術(shù)，減少不確定的復雜成分影響（Maaser et al., 2001），跨細胞上皮電阻法（transepithelial electrical resistance, TER）測定上皮細胞狀況反映腸道屏障功能等等（Klingberg et al., 2005）。這些研究技術(shù)對于現(xiàn)今得到的成果作出了不少的貢獻，是技術(shù)瓶頸的突破。
2.2益生菌群對腸道粘膜細胞免疫的促進作用
腸道粘膜是腸道的主要免疫系統(tǒng)區(qū)域，其中有系統(tǒng)的淋巴組織如派伊爾氏淋巴集結(jié)（Peyer's patch, PP）等起著至關(guān)重要的作用。大量研究表明，粘膜細胞分泌的免疫球蛋白SIgA與益生菌群的關(guān)系密切（Hapfelmeier et al., 2010）；人們也通過對IgA的代謝途徑研究益生菌群對腸道粘膜細胞的免疫促進機理，經(jīng)典的模型如圖2。這個模型認為益生菌群激活粘膜細胞中的T細胞與B細胞，使它們表達α4β7 整聯(lián)蛋白且開始遷移到血液中；同時膜中層的漿細胞（plasma cell）每天分泌3-5g的SIgA抵御腸道致病物質(zhì)的侵害。
圖2 腸道粘膜細胞免疫機制（Thomas et al., 2005）
粘膜細胞中的CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、Th17細胞、Treg細胞（Lee, 2010）巨噬細胞（Ivec et al., 2007）、樹突狀細胞（Dendritic cells, DCs）和嗜酸性細胞等都是人們密切關(guān)注的研究對象（Foligne et al., 2007）；而上皮內(nèi)淋巴細胞（intraepithelial lymphocytes, IEL）為最新的熱門研究對象，IEL的功能尚未清楚，但很可能與腸道腫瘤監(jiān)視有關(guān)。針對IEL的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)試驗也證明IEL的重要地位，下一步將進行深入的體外試驗研究。
2.3益生菌群對腸道細胞的保護作用
益生菌群對腸道損傷的修復作用是研究較為缺乏的方面，但最近Wallace等在2010年研究利用大腸桿菌中的β-葡萄糖醛酸酶抑制劑（β-glucuronidase inhibitor）減輕抗癌藥物CPT-11的腹瀉副作用時，發(fā)現(xiàn)其中一種抑制劑存在保護腸道免受損傷功能（Wallace et al., 2010）。
CPT-11引起腹瀉的代謝途徑和四種β-葡萄糖醛酸酶抑制劑的結(jié)構(gòu)如圖3所示。針對這個代謝途徑，β-葡萄糖醛酸酶抑制劑可中斷SN-38G轉(zhuǎn)變?yōu)橐鸶篂a的SN-38，動物體內(nèi)試驗的腸道切片透射電子顯微照片證明這個方法能有效保護腸道。
圖3 CPT-11引起腹瀉的代謝途徑及β-葡萄糖醛酸酶抑制劑的結(jié)構(gòu)（Wallace et al., 2010）
另外，Pagnini等也通過研究一種益生菌復合制劑VSL#3（含8種益生菌）的藥用功能證明：VSL#3能通過誘導腸道細胞生產(chǎn)TNF-α和激活NF-κB從而保護腸道細胞的絨毛結(jié)構(gòu)完整，同時發(fā)現(xiàn)VSL#3可以使腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）和噬熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）明顯增加，腸道平衡環(huán)境更為穩(wěn)定。另外鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG）的菌毛中發(fā)現(xiàn)含有人類粘液結(jié)合蛋白，也可能與腸道修復相關(guān)（Kankainen et al., 2009）。
對于腸道損傷的防御與修復機制仍然知之甚少，體內(nèi)試驗的影響因素過多，而體外試驗難以模擬受損過程，技術(shù)上仍有待完善，但益生菌群在這方面的功能一定將會得到更深入的研究。
3益生菌對致病菌的屏障作用
3.1益生菌的強粘附能力競爭抑制致病菌
益生菌在腸道上的強粘附能力一直是益生菌益生作用之一，人們對其研究相對較為深入。益生菌群分泌的一系列粘附成分如脂多糖、多糖A、脂磷壁酸和肽聚糖等能刺激腸道上皮細胞厚度增長，主要包, 括粘蛋白如Muc2表達，同時對多種白細胞間介素基因的表達有抑制和刺激作用。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum 299v）被證實能增加Muc2的表達量且抑制致病菌粘附（Wlodarska, 2010），其原理如圖4。微生物相關(guān)分子模式（microbe-associated molecular patterns, MAMPs）是益生菌粘附作用的核心，通過這種模式的分子擴散使腸道上皮細胞層中的杯形細胞分泌Muc2蛋白，從而增加益生菌的粘附效果并抵抗致病菌粘附。
圖4 益生菌群粘附作用與抑制致病菌的機制（Wlodarska, 2010）
小鼠體內(nèi)攻毒試驗證明了益生菌的粘附抗菌作用的效果，而且其作用機理也得到較深入的研究，這些成果將對防治腸道炎癥疾病提供依據(jù)。
3.2益生菌分泌抗菌物質(zhì)
過去對于益生菌分泌抗菌物質(zhì)的研究多數(shù)為酸性物質(zhì)，如乳酸、乙酸、丙酸和正丁酸等，以及抗菌肽及胞外多糖。通常我們簡單地認為，這些有機酸通過降低腸道pH值而發(fā)揮作用。但這種通過降低pH值的機制尚不能很好地解釋其代謝產(chǎn)物與致病菌的密切作用。
一種名為表面層蛋白或S層蛋白（Surface layer protein, Slp）的抗菌功能逐漸引起關(guān)注。浙江大學的Chen等利用大腸桿菌O157:H7（Escherichia coli O157:H）和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）證明：卷曲乳桿菌ZJ001（Lactobacillus crispatus ZJ001）中的S層蛋白能競爭性驅(qū)除致病菌定植腸道（Chen, 2006）。Johnson等在瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）中提取S層蛋白也能抵御大腸桿菌O157:H7的定植（Johnson, 2006）。
Konstantinov等發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌S層蛋白A基因敲除突變株與天然嗜酸乳桿菌對比抗菌能力明顯下降，其原因與腸道樹突狀細胞和T細胞有關(guān)，而且通過純化S層蛋白A經(jīng)體外試驗驗證其猜想（Konstantinov et al., 2008）。針對乳桿菌的S層蛋白的研究成果還未能很好地解釋其抑制致病菌的機制，但在這些基礎(chǔ)上繼續(xù)進行深入研究也能很好地指導乳酸菌產(chǎn)品的開發(fā)與應用。
Fududa等（2011）研究雙歧桿菌保護腸道免受致病菌感染的分子機制時發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌通過產(chǎn)生乙酸預防致病菌感染。一些出現(xiàn)在特定雙歧桿菌中的ATP結(jié)合卡帶式碳水化合物轉(zhuǎn)移子的編碼基因可以為試驗鼠提供保護，防止小鼠感染大腸桿菌O157:H7致死。這一影響作用至少部分歸因于乙酸產(chǎn)量的增加，以及大腸桿菌O157:H7志賀毒素從腸腔到血液的轉(zhuǎn)移途徑的中斷。作者推測，由提供保護作用的雙歧桿菌產(chǎn)生的乙酸改善了腸道由上皮細胞介導的防御作用，從而保護宿主免受致死性感染。
4益生菌群治療腸道疾病的機制
4.1益生菌群與炎癥性腸病的關(guān)系
炎癥性腸病（inflammatory bowel disease, IBD）是熱門研究課題之一，尤其是利用益生菌群防治IBD方面有大量的研究成果。IBD中最為典型的有潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC）和克羅恩氏?。–rohn’s disease, CD）。益生型大腸桿菌Nissle 1917（Escherichia colistrain Nissle 1917）是研究最為深入的IBD治療用菌種之一（Rao et al., 2005），在研究其臨床應用的過程中證明：它的治療機制是通過TLR-2識別系統(tǒng)減少促炎細胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的表達，同時提高IL-10、IL-8和IL-1β的分泌量，而且對于治療潰瘍性結(jié)腸炎有顯著的效果（Schultz, 2008）。另外前文提到的VSL#3益生菌復合制劑也有治療克羅恩氏病的報道，Pagnini等利用VSL#3完全防御了SAMP小鼠的克羅恩氏結(jié)腸炎攻毒模型，通過RT-PCR檢驗證明也是與TNF-α和NF-κB有關(guān)。
此外，益生菌群中的大腸桿菌分泌的吲哚也有可能是治療IBD的機制之一。Bansal等發(fā)現(xiàn)益生大腸桿菌可將L-色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榇罅窟胚?，通過高濃度的吲哚和群體感應信號分子SdiA（quorum sensing signals）可抑制腸出血型大腸桿菌(enterohemorrhagic E. Coli, EHEC)，同時減弱EHEC對腎上腺素和正腎上腺素的趨向性。通過全轉(zhuǎn)錄組分析法分析吲哚與HCT-8細胞系的作用發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白、間隙連接蛋白、粘蛋白和50種細胞骨架蛋白的表達量上升，使EHEC的定植率下降，從而減少IBD的傷害（Bansal et al., 2010）。
益生菌群治療腸道疾病的研究十分豐富，對多種疾病的治療機理的研究也基本探明，但由于疾病的演變速度很快，防治不同的疾病需要不同的機制，因此仍然需要繼續(xù)研究，尤其是針對新型致病菌的治療。
4.2益生菌群與腸道生態(tài)失調(diào)
腸道生態(tài)失調(diào)（dysbiosis）是近年倍受重視的一種非感染性疾病，如多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis, MS）、I型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）和風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）等。
Wu和Lee提出一個益生菌群與腸道生態(tài)的相互作用機制，如圖5。其中分節(jié)絲狀菌（segmented filamentous bacteria, SFB）和脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）是兩個重點關(guān)注的對象。該理論認為：分節(jié)絲狀菌SFB可以激活并增加Th17細胞活性和數(shù)量，提高促炎因子的表達；而脆弱擬桿菌可以調(diào)節(jié)Treg細胞，起到抗炎作用。當分節(jié)絲狀菌和脆弱擬桿菌處于平衡狀態(tài)時，促炎因子和抗炎因子的表達量維持在最優(yōu)狀態(tài)，免疫系統(tǒng)活性處于穩(wěn)定的狀態(tài)，即使加上特異性自身免疫突變（autoimmune-specific mutation）這類引起風濕等疾病的突變，也可以避免疾病發(fā)生。但當分節(jié)絲狀菌這類促炎菌群過多，或者脆弱擬桿菌這類抗炎菌群缺乏等都會引起生態(tài)失調(diào)（Lee et al., 2010）（圖5）。
圖5 益生菌群與生態(tài)失調(diào)機制（Lee et al., 2010）
這個機制的理論雖然仍處于初級階段，但它是一個重要的突破，即益生菌過多或過少都會造成疾病，即對益生菌概念的挑戰(zhàn)。只有在益生菌群處于平衡的狀態(tài)下才可以稱為益生菌，否則為中立菌或致病菌。在這個方向需要進行更深入的研究，但這個機制對益生菌的廣譜功能有很大的指導作用。
5小結(jié)
總體來說，對于益生菌群維持腸道健康的機制的研究已得到較深入的基礎(chǔ)成果，過去的宏觀機制研究豐富，而近年來的分子機制研究也取得了不少的進展，尤其是腸道特定細胞與特定菌種之間的互作機制研究最為深入，如激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB為核心的TLR和Nod等因子的大量研究使益生菌作用于免疫系統(tǒng)的機理得以闡明。
盡管益生菌免疫調(diào)節(jié)的研究較豐富，但對于益生菌分泌針對腸道細胞的轉(zhuǎn)錄因子的研究則鮮有報道。隨著研究的深入，人們對益生菌的益生機理將有更深刻的理解。在腸道菌群已被稱為“人類的器官”的今天，腸道益生菌群的生態(tài)平衡機理有重要的研究價值，益生菌的其他調(diào)節(jié)機制也需進一步研究，從而指導人們制造出穩(wěn)定、有效及安全的益生菌制劑。
參 考 文 獻(略)