乳酸菌細(xì)胞吸附霉菌毒素以減除霉菌毒素的毒害作用閱讀次數(shù) [7187] 發(fā)布時(shí)間 :2017-09-20
乳酸菌細(xì)胞吸附霉菌毒素以減除毒素的毒害作用
胡文鋒，李希，雷柳琳，龐旭，徐健，周舟
（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣州五山，510642）
摘譯、改寫(xiě)自：Amal S. Hathout, Soher E. Aly
Biological detoxification of mycotoxins: a review
Ann Microbiol (2014), 64:905-919.
霉菌產(chǎn)生的霉菌毒素污染了25％人類(lèi)消費(fèi)的谷物和糧食，其中，黃曲霉毒素的毒性最大(Wild and Turner, 2002; CAT, 2003) 。黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）和紅綬曲霉（Aspergillus nomius）污染的玉米、高粱、大米、花生、堅(jiān)果、無(wú)花果、生姜、肉豆蔻和牛奶，可產(chǎn)生對(duì)肝臟致癌的黃曲霉毒素(Ellis et al., 1991; FDA, 2012) 。黃曲霉毒素是由一些曲霉屬真菌合成的低分子量的次級(jí)代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素包括四種類(lèi)型，分別是黃曲霉毒素B1（最致癌）、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2。它們?cè)谕米芋w內(nèi)的最大半致死劑量（LD50）值為0.3mg / kg BW，老鼠為18mg / kg BW(Moss, 1998；IARC, 2002; FDA, 2012)。2012年，黃曲霉毒素被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)歸類(lèi)為1類(lèi)致癌物質(zhì)(i.e., carcinogenic to humans; IARC, 2014) 。
許多國(guó)家經(jīng)常報(bào)道食品和飼料中發(fā)現(xiàn)了黃曲霉毒素污染。例如，有報(bào)告顯示，農(nóng)產(chǎn)品被高水平的黃曲霉毒素B1污染，包括干果、谷物、水果、蔬菜、香草和香料，其最高含量超過(guò)了最大允許限度(Chen et al., 2013; Guchi, 2015; Waliyar et al., 2015) 。此外，牛奶和奶制品（包括奶酪，酸奶和奶油）中出現(xiàn)黃曲霉毒素M1的污染，甚至在巴氏殺菌后的牛奶中仍存在(Yitbarek and Tamir, 2013) 。此外，在Greater Addis Ababa奶牛棚里，發(fā)現(xiàn)在牛奶和乳牛飼料中有高水平的黃曲霉毒素，污染水平分別為0.028-4.98μg/ L和70-419μg/ L (Gizachew et al., 2016) 。
減少霉菌毒素對(duì)人和動(dòng)物毒素作用的常用方法是利用各種霉菌毒素結(jié)合劑或吸附劑來(lái)降低其生物利用度，從而減少霉菌毒素的攝取。近年來(lái)人們開(kāi)發(fā)了物理、化學(xué)和生物的方法去除食品或飼料中的霉菌毒素。本文只介紹乳酸菌的吸附去毒作用及機(jī)制。
雙歧桿菌屬去除霉菌毒素
雙歧桿菌是乳酸菌之一，革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，經(jīng)常分支的厭氧細(xì)菌屬。它們是普遍存在于哺乳動(dòng)物和其他動(dòng)物的胃腸道和口腔內(nèi)共生菌，其中一些雙歧桿菌是益生菌。 Peltonen等人（2001）研究了五種雙歧桿菌菌株在磷酸鹽緩沖液（PBS）中的對(duì)黃曲霉毒素B1（AFB1）的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌菌株結(jié)合AFB1的18.0-48.7％。Fuchs等（2008）通過(guò)雙歧桿菌研究了兩種豐富的常見(jiàn)的霉菌毒素，赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）和棒曲霉毒素（patulin，PAT）的解毒作用，發(fā)現(xiàn)兩株長(zhǎng)雙歧桿菌（LA 02，VM 14）菌株的解毒作用非常高效，OTA降低了約50％；而對(duì)于PAT，用動(dòng)物雙歧（VM12）菌株觀察到最強(qiáng)的作用（約降低80％）。Hateb等人（2012a）報(bào)道，雙歧桿菌671在培養(yǎng)24小時(shí)后，其最大吸附值達(dá)活細(xì)胞52.9％，滅活細(xì)胞54.1％。
有人研究了兩株乳制品源的雙歧桿菌在磷酸緩沖液（PBS）和復(fù)原乳中去除AFM1的能力，結(jié)果表明活細(xì)胞（10^8 CFU/ml）和熱滅活雙歧桿菌對(duì)黃曲霉毒素M1去除率分別達(dá)到14.04％至28.07％，在PBS和復(fù)原乳中分別為12.85％至27.31％（Kabak和Var 2008）。以前的研究還發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的AFM1結(jié)合能力分別達(dá)到26.7％和32.5％（Kabak和Var 2004）。
另外，Lankaputhra和Shah（1998）研究了9株雙歧桿菌的活細(xì)胞和滅活細(xì)胞對(duì)八種化學(xué)誘變劑和前誘變劑（promutagens）（N-甲基，N'-硝基，N-亞硝基胍，2-硝基呋喃，四氫呋喃，四氫呋喃， ，2-硝基喹啉-N-氧化物; AFB1; 2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并喹啉; 2-氨基-1-甲基-6-苯基 - 咪唑并（4,5-b）吡啶 ，和2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并（3,3-6）吲哚））的抗誘變活性，包括。 作者報(bào)道，其中6株雙歧桿菌對(duì)抑制AFB1毒性其效果不明顯。
乳酸菌（乳桿菌）去除霉菌毒素
Aflatoxins 黃曲霉毒素
乳酸菌（LAB）的某些乳制品源菌株可有效地從溶液中去除AFB1，這是最常見(jiàn)的黃曲霉毒素（El-Nezami等，1996，1998a）。El-Nezami等人 （1998b）評(píng)估了5種乳桿菌物質(zhì)體外結(jié)合黃曲霉毒素的能力，發(fā)現(xiàn)益生菌菌株如鼠李糖乳桿菌GG和鼠李糖乳桿菌LC-705對(duì)于除去AFB1是非常有效的，其中在20μg mL-1溶液中超過(guò)80％的毒素被捕獲。同時(shí)假設(shè)AFB2、AFG1和AFG2對(duì)這種結(jié)合過(guò)程不太敏感（El-Nezami等人2002b）。Peltonen等人 （2000）補(bǔ)充研究發(fā)現(xiàn)，益生菌從緩沖溶液中除去AFB1的范圍為5.8-31.3％。 Peltonen等人 （2001）研究了12種乳桿菌和3種乳球菌菌株在PBS中對(duì)AFB1的結(jié)合能力。在他們的研究中，乳桿菌結(jié)合17.3-59.7％的AFB1，而乳球菌屬菌株結(jié)合了5.6-41.1％的AFB1。 Khanafari等人 （2007）研究了植物乳桿菌（PTCC 1058）結(jié)合AFB1的功效，吸附1小時(shí)后從溶液中除去了45％的AFB1，高壓滅菌的細(xì)菌去除AFB1的能力為1小時(shí)內(nèi)約31％。 作者補(bǔ)充說(shuō)，三次洗滌后，益生菌保留了92％的AFB1。 AFB1通過(guò)LAB的體外結(jié)合為快速（不超過(guò)1分鐘）和可逆過(guò)程（Bueno等，2006），其為菌種和劑量依賴(lài)性（Kankaanp??等，2000）。
Hernandez-Mendoza等 （2009）根據(jù)結(jié)合AFB1的能力，篩選出8株干酪乳桿菌，其吸附率介于14?49％。 以前的關(guān)于干酪乳桿菌對(duì)AFB1結(jié)合水平的研究發(fā)現(xiàn)其結(jié)合率介于0.6至46％之間（Bolognani等，1997; El-Nezami等，1998a; Peltonen等，2000,2001; Haskard等，2001; Lahtinen等 2004; Hwang et al.2005; Zinedine et al.2005）。 Hernandez-Mendoza等 （2010）提出，即使在長(zhǎng)時(shí)間的毒素暴露后，干酪乳桿菌Shirota的存在也可以降低腸道水平的黃曲霉毒素吸收，從而降低其毒性作用。 他們補(bǔ)充說(shuō)，干酪乳桿菌Shirota具有將AFB1結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞外套膜中的能力，并且圖像還顯示，黃曲霉毒素結(jié)合導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)變化，從而改變了細(xì)菌細(xì)胞表面。
Halttunen等人 （2008）研究了LAB組合菌株去除霉菌毒素的能力，并揭示了LAB組合菌株的毒素去除能力不是其個(gè)體能力的總和。 因此，當(dāng)目標(biāo)是去除單一毒素時(shí)應(yīng)使用純的單一菌株，當(dāng)要一起去除多種毒素時(shí)，使用組合菌株可能更有效。
Lankaputhra和Shah（1998）研究了6株嗜酸乳桿菌的活細(xì)胞和滅活細(xì)胞對(duì)8種化學(xué)誘變劑和前誘變劑（promutagens）（N-甲基，N'-硝基，N-亞硝基胍; 2-硝基呋喃; 4-硝基-O苯二胺; 4-硝基喹啉-N-氧化物; AFB1; 2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并喹啉; 2-氨基-1-甲基-6-苯基 - 咪唑并[4,5-b]吡啶和2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[3,3-6]吲哚）的抗誘變活性，包括AFB1。作者報(bào)道，除嗜酸乳桿菌2415株外，所有嗜酸乳桿菌菌株均在高濃度時(shí)抑制AFB1的基因毒性（> 50％）。發(fā)酵乳制品或益生菌的抗誘變活性的機(jī)理尚未明確（Nadathur等，1994）。誘變劑與微生物細(xì)胞的結(jié)合可能成為抗誘變性的作用機(jī)制（Orrhage等，1994）。Cenci等（2008）研究了鼠李糖乳桿菌GG對(duì)抗基因毒素的效果，包括AFB1（4-硝基喹啉-1-氧化物，N-甲基-N-硝基 - 亞硝基胍，2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉和AFB1 ），結(jié)果顯示其具有很高的抗AFB1基因毒性的能力（80.8％）。
根據(jù)污染水平和孵化期的不同，活的乳桿菌細(xì)胞濃度為108 CFU mL-1在PBS中的對(duì)AFM1結(jié)合率為10.22%?26.55％（Kabak和Var 2008）。 他們補(bǔ)充道，熱滅活細(xì)菌在PBS中去除AFM1的百分比為14.04%至28.97％。似乎滅活細(xì)胞的吸附能力更強(qiáng)。類(lèi)似地，Kabak和Var（2004）發(fā)現(xiàn)，乳桿菌在PBS和復(fù)原乳中的AFM1的結(jié)合能力為25.7％至30.5％之間。 這些結(jié)果低于Pierides等報(bào)道的結(jié)果（2000），他發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)15~16h，活乳酸桿菌菌株結(jié)合AFM1能力為18.1%?50.7％。
Ocharatoxin A 赭曲霉毒素A（OTA）
由于乳桿菌和鏈球菌的作用，在牛奶中觀察到OTA的降解（Skrinjar等，1996）。 Turbic等 （2002）的研究結(jié)果顯示，OTA（36-76％）被高濃度和適量濃度的鼠李糖乳桿菌菌株去除。同時(shí)，Heidler和Schatzmayr（2003）清楚地表明，從瘤胃液中分離的牛犢乳桿菌（Lactobacillus vitulinus）能夠?qū)TA分解成無(wú)毒代謝物赭曲霉毒素α（OTα）和氨基苯丙氨酸。類(lèi)似的研究表明，乳桿菌能夠消除添加到培養(yǎng)基中的0.05 mg L?1 OTA，特別是保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌，分別消除了94％, 72％和46％的OTA（B?hm et al。2000）。
Del Prete et al.（2007）研究了OTA與葡萄酒LAB（乳桿菌屬、片球菌屬和歐洲綠球菌）的體外相互作用。 結(jié)果顯示，在液體合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的幾種葡萄酒LAB菌株引起的OTA濃度降低。 OTA濃度的降低范圍為8.23％?28.09％。 還有人注意到，商業(yè)亞麻型菌株比其他分析的葡萄酒LAB更有效，OTA降低范圍為17.35至28.09％。
在腸道和植物來(lái)源的LAB菌株消除OTA的研究中，Piotrowska和Zakowska（2005）根據(jù)對(duì)OTA的敏感度及其從液體培養(yǎng)基中去除這種毒素的能力篩選出乳桿菌屬和乳球菌屬的29株LAB。 他們補(bǔ)充道，使用嗜酸乳桿菌CH-5、鼠李糖乳桿菌GG、植物乳桿菌BS、短乳桿菌和乳酸乳桿菌獲得最大吸附量，除去超過(guò)50％的初始濃度的OTA。Piotrowska和Zakowska（2000）得出結(jié)論，通過(guò)與細(xì)菌生物量的結(jié)合發(fā)生毒素的消除。
Fuchs等人 （2008）研究了LAB對(duì)OTA的脫毒作用。他們發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌對(duì)OTA含量的降低作用最強(qiáng)（97％）。因而值得注意的是，瘤胃代表微生物群落是通過(guò)裂解OTA肽鍵而解毒，從而有苯丙氨酸釋放出來(lái)（Hult等，1976;?zpinar等，1999）。
Patulin展青霉毒素（棒曲霉毒素，PAT）
Fuchs等人 （2008）研究了LAB對(duì)展青霉毒素（PAT）的影響，并注意到植物乳桿菌降低PAT含量的作用最強(qiáng)（39％）。 Hateb等人 （2012a）報(bào)道，水溶液中PAT最大吸附量為培養(yǎng)24小時(shí)后的乳酸桿菌6149菌株，其活細(xì)胞達(dá)到51.1％，滅活細(xì)胞達(dá)到52.0％。 PAT的最高去除率條件為pH4.0和37℃，并且隨著毒素濃度的降低而升高。有人使用10種不同的滅活LAB從蘋(píng)果汁中去除PAT污染，結(jié)果表明,鼠李糖乳桿菌滅活細(xì)胞可降低PAT達(dá)80.4％（Hateb等，2012b）。
Fusarium toxins鐮刀菌毒素
已知某些LAB菌株能夠解毒鐮刀菌毒素（DON、NIV、T-2毒素、HT-2毒素）（El-Nezami等，2002a; Niderkorn等，2006）和玉米赤霉烯酮（ZEN） （El-Nezami等，2002c，2004）。 Niderkorn等人（2006）發(fā)現(xiàn)，盡管伏馬菌素FB1和FB2的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，但FB2比FB1的去除率更高。 他們認(rèn)為，是通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合鐮刀菌霉菌毒素而不是生物降解的方式去除毒素。因此，吸附脫毒不存在關(guān)于毒素的酶解產(chǎn)物的毒性問(wèn)題。霉菌毒素-LAB相互作用的強(qiáng)度受細(xì)胞壁中肽聚糖結(jié)構(gòu)的影響，更準(zhǔn)確地說(shuō)是受其氨基酸組成的影響（Niderkorn等人，2009）。
El-Nezami等人研究了鼠李糖乳桿菌GG和鼠李糖乳酸桿菌LC-705從液體培養(yǎng)基中去除ZEN及其衍生物α-玉米赤霉烯醇的能力（2002c）。他們注意到，這些毒素（38％和46％）中有相當(dāng)一部分被細(xì)菌顆粒捕獲，并且在培養(yǎng)3天后沒(méi)有觀察到ZEN或α-玉米赤霉烯醇的降解產(chǎn)物。 作者補(bǔ)充道，經(jīng)過(guò)熱處理和酸處理的細(xì)菌都能夠去除ZEN和α-玉米赤霉烯醇，表明吸附作用才是從培養(yǎng)基中去除兩種毒素的機(jī)制，而非代謝作用。該過(guò)程是快速的并且取決于細(xì)菌細(xì)胞及毒素的濃度。
Niderkorn等人 （2007）報(bào)道，8株乳桿菌和3種明串珠菌屬將ZEN轉(zhuǎn)化成α-玉米赤霉烯醇，但DON和伏馬毒素不能被生物轉(zhuǎn)化。 他們補(bǔ)充道，這不能被認(rèn)為是解毒，因?yàn)棣?玉米赤霉烯醇具有比ZEN高3到4倍的雌激素活性（Mirocha等，1979）。 從ZEN到α-玉米赤霉烯醇的生物轉(zhuǎn)化可能解釋了Mokoena等人的研究結(jié)果（2005），他們觀察到LAB在玉米粉發(fā)酵過(guò)程中ZEN的濃度顯著降低，但其毒性并沒(méi)有降低。 意味著ZEN通過(guò)疏水相互作用主要結(jié)合LAB細(xì)胞壁的碳水化合物部分（El-Nezami等人，2004）。 由于疏水相互作用相對(duì)較弱，這種細(xì)菌-霉菌毒素復(fù)合物可能不穩(wěn)定。 Niderkorn等人（2007）也提出，細(xì)菌吸附ZEN不限于疏水性連接，其他類(lèi)型的相互作用可能也是重要的。
霉菌毒素的體外去除機(jī)制
為了研究LAB去除霉菌毒素的機(jī)制，有許多研究比較了活菌和熱滅活菌的作用（Haskard et al.2001; El-Nezami et al。1998b，2002a）?；蛘?，將細(xì)菌細(xì)胞用酶（如鏈霉蛋白酶E和脂肪酶）或高碘酸鹽處理，以改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)（Haskard等人2000; El-Nezami等人2004; Lahtinen等人2004）。 然而，由于LAB的細(xì)胞溶質(zhì)制劑也有降低毒性的作用，所以假定其他機(jī)制（例如與短鏈脂肪酸的相互作用）也可能發(fā)揮作用（Knasmuller et al.2001; Stidl et al 2007; Stidl等人2008）。
在LAB中，細(xì)胞壁組成包括（1）肽聚糖層，其形成容納其它組分如磷壁酸和脂磷壁酸的細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)；（2）蛋白質(zhì)S層，以及（3）中性多糖（Delcour等人1999）。這些組分具有各種功能，包括粘附以及與大分子結(jié)合。各種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，肽聚糖和多糖參與毒素吸附（Zhang和Ohta， 1991; Peltonen等，2001; Haskard等，2001; Lahtinen等，2004）。 Haskard等人（2000）研究了AFs和鼠李糖乳桿菌之間結(jié)合的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)結(jié)合主要發(fā)生在碳水化合物上，并且一些擴(kuò)展了細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)組分。這些結(jié)果是基于高碘酸酯和鏈霉蛋白酶E對(duì)鼠李糖乳桿菌AFB1結(jié)合的抑制作用。高碘酸酯和鏈霉蛋白酶E可分別用于相對(duì)非特異性降解碳水化合物和蛋白質(zhì)。他們還描述了疏水相互作用在結(jié)合中的主要作用，靜電相互作用次之。
另外，已經(jīng)表明AFB1通過(guò)弱的非共價(jià)相互作用結(jié)合細(xì)菌，例如與細(xì)菌表面上的疏水基團(tuán)相關(guān)聯(lián)（Peltonen等，2001）。 然而，AFB1結(jié)合可能涉及多個(gè)成分（Turbic等人，2002），并且這種相互作用可能受環(huán)境條件的影響。
霉菌毒素的體內(nèi)去除機(jī)制
已經(jīng)顯示幾種益生菌在體外能有效地結(jié)合AFB1（Lee等人2003; Shahin 2007），但離體結(jié)果有爭(zhēng)議（El-Nezami等人2000）。因?yàn)樵趧?dòng)物腸道環(huán)境條件下其結(jié)果可能完全不同，例如pH（Haskard et al.2000,2001）和腸粘液。Gratz等人 （2004）報(bào)道，將兩種益生菌制劑（鼠李糖乳桿菌GG和鼠李糖乳桿菌LC-705加弗拉登克氏原乳桿菌shermanii JS（LC-705 + JS）與AFB1或粘液的預(yù)培養(yǎng)分別減少了隨后的粘液和AFB1的表面結(jié)合 ，表明復(fù)合的益生菌制劑在粘液存在下對(duì)AFB1的吸附減少，并且更易受腸道中干擾因子的影響，這可能解釋動(dòng)物體內(nèi)AFB1結(jié)合較差的原因（Gratz等人，2004）。
2005年，Gratz等研究了益生菌混合物（鼠李糖乳桿菌LC-705加弗氏弗氏厭心菌亞種shermanii JS）離體結(jié)合AFB1的能力。結(jié)果顯示，益生菌混合物使十二指腸中AFB1的水平降低了25％。 此外，Tuomola等人 （2000）的研究顯示，熱處理可以干擾鼠李糖乳桿菌GG和LC-705的粘液粘附力，并得出結(jié)論：蛋白質(zhì)必須參與粘液的結(jié)合，而碳水化合物可與AFB1結(jié)合（Haskard等，2000）。
還有證據(jù)表明，具有最有效的AFB1去除能力的LAB可以減少AFB1在雞的胃腸道中被雞吸收（El-Nezami等人，2000）。 根據(jù)El-Nezami等人 （2006）的發(fā)現(xiàn)，使用兩種益生菌菌株減少了年輕中國(guó)男性對(duì)AFB1的吸收。
Hernandez-Mendoza等（2011）評(píng)估了羅伊氏乳桿菌在腸道中結(jié)合AFB1的能力，并確定該菌株能夠在腸道中結(jié)合AFB1，主要在十二指腸中，并且在接受AFB1加細(xì)菌的動(dòng)物中AFB1-賴(lài)氨酸加合物的含量明顯低于僅接受AFB1的AFB1-賴(lài)氨酸加合物，因此證明細(xì)菌在正常腸道條件下作為生物屏障的能力，從而降低口服攝入的AFB1的生物利用度。 Hathout等人 （2011）評(píng)估了干酪乳桿菌和羅伊氏乳桿菌對(duì)大鼠AF-誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，并報(bào)道了用細(xì)菌處理能夠顯著改善肝臟的所有生物化學(xué)參數(shù)和組織學(xué)圖像。
結(jié)論
活的或滅活的乳酸菌可以通過(guò)將毒素結(jié)合到其細(xì)胞壁組分，或通過(guò)將毒素降解為毒性較低或無(wú)毒的化合物，從而實(shí)現(xiàn)去除食物或飼料中的霉菌毒素。鼠李糖乳桿菌GG、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌等可利用其細(xì)胞壁中的肽聚糖有效地結(jié)合霉菌毒素。乳桿菌和雙歧桿菌對(duì)霉菌毒素的結(jié)合能力，可應(yīng)用為食品與飼料中的霉菌毒素脫毒劑。